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流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)溶液中單個(gè)細(xì)胞或顆粒進(jìn)行快速、多參數(shù)分析的技術(shù)。流式細(xì)胞儀利用激光作為光源，照射在細(xì)胞上，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)，由檢測(cè)器如光電二極管或光電倍增管讀取。之后，這些信號(hào)被轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析，并寫(xiě)入標(biāo)準(zhǔn)格式(.fcs)數(shù)據(jù)文件。另外，細(xì)胞群可以根據(jù)其熒光或散射光的特性進(jìn)行分析或分選。

用于流式細(xì)胞術(shù)的儀器在過(guò)去的幾十年里不斷“進(jìn)化"著，以滿(mǎn)足越來(lái)越多的科研與臨床應(yīng)用需求。上海晶抗生物將為大家簡(jiǎn)單介紹幾種流式細(xì)胞儀。

傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀由液流、光學(xué)和電子(檢測(cè)分析)三個(gè)系統(tǒng)組成。

液流系統(tǒng)

液流系統(tǒng)主要由鞘液(通常是一種緩沖鹽水溶液)構(gòu)成。在一定壓力下，鞘液將細(xì)胞或顆粒聚焦在一條直線，并將其輸送到激光攔截點(diǎn)。

光學(xué)系統(tǒng)

光學(xué)系統(tǒng)由激發(fā)光 (激光器)和收集光 (光電倍增管或PMTs和光電二極管)組成，產(chǎn)生用于分析樣品的散射光和熒光信號(hào)。一系列的雙色向?yàn)V光片可引導(dǎo)熒光到特定的探測(cè)器，以便每一個(gè)單獨(dú)的熒光色素可以被檢測(cè)和測(cè)量。更具體地說(shuō)，雙色向?yàn)V光片只允許波長(zhǎng)較短或較長(zhǎng)的光通過(guò)，并以一定角度反射不能通過(guò)的光。例如，450雙色向長(zhǎng)通濾光片(DLP)讓波長(zhǎng)大于450 nm的光通過(guò)濾光片，并以一定角度反射較短波長(zhǎng)的光，發(fā)送到另一個(gè)探測(cè)器。帶通濾光片只允許一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光通過(guò)。例如，450/50帶通濾光片只允許波長(zhǎng)為450 +/- 25 nm的熒光通過(guò)。

電子系統(tǒng)

電子系統(tǒng)將探測(cè)器發(fā)出的信號(hào)轉(zhuǎn)換成可以被計(jì)算機(jī)讀取的數(shù)字信號(hào)。

常見(jiàn)的多激光系統(tǒng)通常有20個(gè)參數(shù)(FSC, SSC和18個(gè)熒光探測(cè)器)。目前，一些新的儀器正在引入5個(gè)或更多的激光器，并設(shè)置30-50個(gè)參數(shù)，但這并不常見(jiàn)。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀使用的常見(jiàn)的激光是488nm(藍(lán)色)、405nm(紫色)、532nm(綠色)、552nm(綠色)、561 nm(綠)、640 nm(紅色)和355 nm(紫外線)，還有一些不常見(jiàn)的激光可用于特定用途。此外，還有一些儀器已經(jīng)用電子崩光電二極管(APD)取代光電倍增管(PMT)用于熒光檢測(cè)，目的是提高檢測(cè)的靈敏度。流式細(xì)胞儀系統(tǒng)組成示意圖

聲波聚焦流式細(xì)胞儀

聲波聚焦流式細(xì)胞儀可以使用超聲波更好地將細(xì)胞聚焦于一條直線，進(jìn)行激光照射。即使在較高的進(jìn)樣速度下，聲波聚焦技術(shù)也可以精確地將細(xì)胞定位在液流的中心，因此細(xì)胞信號(hào)的變異系數(shù)較小，數(shù)據(jù)質(zhì)量更高。作為對(duì)比，同樣在高進(jìn)樣速度下，傳統(tǒng)的流體動(dòng)力學(xué)聚焦由于鞘液壓力相對(duì)變小，樣本流的中心部分變寬，導(dǎo)致信號(hào)變異系數(shù)增大、數(shù)據(jù)質(zhì)量下降。此外，聲波聚焦的方式允許更高的上樣量，并能夠減少樣品堵塞。聲波聚焦流式細(xì)胞儀可以利用多達(dá)4種激光和14個(gè)熒光通道對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

聲波聚焦和流體動(dòng)力學(xué)聚焦對(duì)比示意圖

細(xì)胞分選儀

細(xì)胞分選儀是傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀中的一種特殊類(lèi)型，它允許用戶(hù)根據(jù)所需參數(shù)，選擇特定的細(xì)胞群或顆粒群，然后將這些細(xì)胞或顆粒引導(dǎo)到收集容器中，以供進(jìn)一步研究。

細(xì)胞分選儀對(duì)樣品液流進(jìn)行高頻振蕩，以產(chǎn)生液滴來(lái)分離細(xì)胞。然后，液滴被賦予正電荷或負(fù)電荷，并通過(guò)金屬偏轉(zhuǎn)板，在那里它們根據(jù)電荷被導(dǎo)向一個(gè)特定的收集容器。收集容器可以是管狀、載玻片或板狀(96孔或384孔較為常見(jiàn))。

細(xì)胞分選儀有兩種類(lèi)型，石英比色皿型和噴氣管型，它們的不同之處在于激光照射點(diǎn)的位置。石英比色皿型細(xì)胞分選儀具有固定的激光照射線路，更容易為分選做好準(zhǔn)備。噴氣管型細(xì)胞分選儀需要每天對(duì)激光照射線路進(jìn)行校準(zhǔn)，設(shè)置起來(lái)更困難，但更適合小顆粒檢測(cè)。

流式細(xì)胞分選儀

成像流式細(xì)胞儀

成像流式細(xì)胞儀(IFC)結(jié)合了傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡系統(tǒng)，這允許在單細(xì)胞和群體細(xì)胞水平上快速分析樣品的形態(tài)和多參數(shù)熒光。IFC可以像共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡那樣跟蹤單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分布，也可以像流式細(xì)胞儀那樣處理大量細(xì)胞。它們?cè)诙喾N應(yīng)用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、共定位研究、細(xì)胞間相互作用、DNA損傷和修復(fù)，以及需要對(duì)大量細(xì)胞的細(xì)胞定位與熒光表達(dá)進(jìn)行協(xié)調(diào)的應(yīng)用。

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀結(jié)合了飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和流式細(xì)胞儀的功能。使用這種儀器時(shí)，細(xì)胞用重金屬離子標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記，而不是熒光標(biāo)記抗體，并使用時(shí)間飛行質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。但質(zhì)譜流式細(xì)胞儀不具備FSC或SSC光檢測(cè)功能，因此無(wú)法使用常規(guī)方法檢測(cè)細(xì)胞聚集體。此外，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)不具有細(xì)胞自身熒光信號(hào)，試劑不具有與熒光標(biāo)記相關(guān)的發(fā)射光譜重疊，因此不需要補(bǔ)償。然而，樣品在分析過(guò)程中會(huì)被破壞，因此無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞分選，并且采集速率遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀。

用于微珠陣列分析的細(xì)胞儀

多重微珠陣列在分析小體積樣品中的大量分析物方面已變得流行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些檢測(cè)利用在特定通道中具有已知熒光量的捕獲珠和由單獨(dú)的激光檢測(cè)到的報(bào)告分子，來(lái)量化與特定珠相關(guān)的捕獲分析物的數(shù)量。

光譜流式細(xì)胞儀

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的挑戰(zhàn)之一是熒光色素之間的補(bǔ)償(或消除光譜重疊)。一種新型的流式細(xì)胞儀，光譜分析儀就是專(zhuān)門(mén)針對(duì)這一問(wèn)題而設(shè)計(jì)的。光譜分析儀測(cè)量多色樣品中每個(gè)熒光色素的整個(gè)熒光發(fā)射光譜，以創(chuàng)建光譜指紋。然后在分析過(guò)程中，每個(gè)光譜是未混合的，為每個(gè)熒光色素提供一個(gè)純信號(hào)。光譜分析正逐漸取代傳統(tǒng)的PMTs作為高維流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)方法。

納米型流式細(xì)胞儀

納米型流式細(xì)胞儀覆蓋了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀 200nm 以下粒徑顆粒的檢測(cè)盲區(qū)，可檢測(cè)納米顆粒以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)菌，病毒，細(xì)胞外囊泡（外泌體）等，對(duì)它們的粒徑、分布、顆粒濃度以及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行高分辨、高選擇性、高通量的檢測(cè)。